【多肽定制】多肽的結(jié)構(gòu)分析方法

(一)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——質(zhì)譜

經(jīng)典的多肽測(cè)序方法包括N末端序列測(cè)定的化學(xué)方法，如Edman法、C末端酶解方法及C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一定缺陷。例如作為多肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate，PITC)分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測(cè)序速度較慢(每天50個(gè)氨基酸殘基)；樣品用量較大(nmol級(jí)或幾十pmol級(jí))；對(duì)樣品純度要求很高；對(duì)修飾氨基酸殘基往往會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤識(shí)別，而對(duì)N末端保護(hù)的肽鏈則無法測(cè)序。C末端化學(xué)降解測(cè)序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)由于具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性而備受關(guān)MS用于多肽序列測(cè)定時(shí)，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大而明顯降低，所以采用MS進(jìn)行多肽序列分析比蛋白質(zhì)簡單，許多研究均是以多肽作為分析對(duì)象。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ES)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/Ionization，MALD)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，使極性大分子多肽的分析成為可能，檢測(cè)限可達(dá)fmol級(jí)，可測(cè)定的分子量范圍則高達(dá)100kDa。目前MALD已成為測(cè)定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具。

(二)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——核磁共振

由于信號(hào)的純數(shù)字化、重疊范圍過寬(由于相對(duì)分子質(zhì)量太大)和信號(hào)弱等，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)圖譜在多肽的分析中應(yīng)用較少，隨著二維、三維以及維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，NMR才逐漸成為多肽分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列及定量混合物中的各組分含量等，但應(yīng)用于多分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的多肽有特定的形狀面便于定量與定性分析，如何縮短數(shù)據(jù)處理的時(shí)間等，這些問題均有不少學(xué)者在進(jìn)行研究，NMR在分析含少于30個(gè)氨基酸的多肽時(shí)比較有效

最近的超高場超導(dǎo)磁鐵的建造已將NMR研究的分子質(zhì)量范圍擴(kuò)展到100kD以上如此大的蛋白質(zhì)分子，其NMR譜常遇到譜帶增寬的問題，Wuthrich等研究的橫向池豫優(yōu)化光譜法(transversal relaxation optimized spectroscop，TRDSY為此提供了解決方法

(三)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——紅外光譜

動(dòng)圖封面

紅外光譜是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要方法，具有樣品用量小和不需要高純晶體等特點(diǎn)。用紅外光譜法研究多肽等的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象，能反映與正常生理?xiàng)l件(水溶液、溫度、酸堿性等）相似情況下的生物大分子的結(jié)構(gòu)變化信息，這是用其它方法難以做到的。

用傅里葉變換紅外光譜方法研究蛋白質(zhì)和多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要是對(duì)紅外光譜中的酰胺I譜帶(氘代后，稱酰胺I譜帶)進(jìn)行分析，酰胺I譜帶為α螺旋，β折疊、無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角等不同結(jié)構(gòu)振動(dòng)峰的加合帶，彼此重疊，在1620~42500px-1范圍內(nèi)通常為一個(gè)不易分辨的寬譜帶。目前常應(yīng)用去卷積微分等數(shù)學(xué)方法，對(duì)加合帶中處于不同波數(shù)的各個(gè)吸收峰進(jìn)行分辨，最后經(jīng)譜帶擬合，獲得各個(gè)吸收峰的定量信息。

紅外光譜可用于監(jiān)測(cè)酰胺質(zhì)子的交換速率，暴露于表面的質(zhì)子比處于中心的質(zhì)子H/D交換要快得多。內(nèi)部伸縮區(qū)或參與二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的酰胺質(zhì)子交換速率為中等。它可以提供多肽或蛋白質(zhì)的所有氨基酸殘基的信息。

(四)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——紫外光譜

在研究生物大分子的溶液構(gòu)象時(shí)，紫外可見吸收光譜是十分重要的方法。它對(duì)測(cè)定樣品沒有特殊要求，只需處于溶液狀態(tài)即可，因此紫外光譜在探索生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面可獲得有意義的信息。蛋白質(zhì)在紫外光范圍內(nèi)(250~300mm)的光吸收主要是由于芳香族氨基酸Trp及Tyr，其次是Phe和His的電子激發(fā)引起的。

(五)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——圓二色譜

多肽多為手性分子，實(shí)驗(yàn)室主要采用圓二色譜(circular Dichroism spectra，CD)研究分子的立體結(jié)構(gòu)、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及在溶液中的構(gòu)象變化等。CD譜具有UV分析相同的精密度但比UV的靈敏度高，而且在UV譜中的重疊的峰在CD譜中也有可能分開。CD的測(cè)定通常是分子橢圓度[θ]的測(cè)定，它表示該物質(zhì)由于分子的光學(xué)不對(duì)稱性而對(duì)左、右圓偏振光有不同程度的吸收。根據(jù)Cotton效應(yīng)，[θ值只在吸收峰有較大的值，并且與吸收峰波長位置相對(duì)應(yīng)，而多肽的紫外吸收光譜主要有兩個(gè)吸收峰，在280m處的吸收峰由芳香族側(cè)鏈引起(主要是Tyr、Tp、Phe)，但在波長約低于230mm時(shí)，不但有其他氨基酸側(cè)鏈的電子躍遷，還有肽鏈骨架本身電子位移的躍遷所引起的吸收，因而通過對(duì)這一區(qū)域的CD研究可以分析多肽主鏈的構(gòu)象。

(六)多肽的結(jié)構(gòu)分析方法——X射線晶體學(xué)

X射線晶體學(xué)方法是迄今為止研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有效的方法，所能達(dá)到的精度是任何其他方法所不能比擬的。其缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)/多肽的晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定的周期較長。X射線衍射技術(shù)能夠精確測(cè)定原子在晶體中的空間位置；中子衍射和電子衍射技術(shù)則用于彌補(bǔ)X射線衍射技術(shù)的不足。生物大分子單晶體的中子衍射技術(shù)用于測(cè)定生物大分子中氫原子的位置；纖維狀生物大分子的X射線衍射技術(shù)用于測(cè)定這類大分子的一些周期性結(jié)構(gòu)，如螺旋結(jié)構(gòu)等；電子顯微鏡技術(shù)能夠測(cè)定生物大分子的大小、形狀及亞基排列的二維圖像；它與光學(xué)衍射和濾波技術(shù)結(jié)合而成的三維重構(gòu)技術(shù)能夠直接顯示生物大分子低分辨率的三維結(jié)構(gòu)。

除上述方法之外，場解析質(zhì)譜、生物鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法及兔疫學(xué)方法等都已應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定、分析檢測(cè)之中。