合成多肽藥物可視為界于有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)大分子之間的一類特殊藥物。在《制備工藝和過程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》［1］中已對(duì)合成多肽藥物制備工藝部分進(jìn)行了論述，本文主要就合成多肽藥物質(zhì)控項(xiàng)目設(shè)置的合理性和雜質(zhì)譜研究的全面性進(jìn)行探討。

1、相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則

合成多肽作為一類特殊的藥物，其氨基酸序列、潛在的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及制備工藝和質(zhì)控要求等，與經(jīng)典小分子化學(xué)藥物相比有明顯差異，具有多樣性和復(fù)雜性，也可能是這個(gè)原因，國內(nèi)外指導(dǎo)文件很少涉及此類品種。FDA 于1994 年發(fā)布了“Guidance forIndustry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances”，國家食品藥品監(jiān)督管理總局( CFDA) 于2007 年發(fā)布了“合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”，2個(gè)指導(dǎo)原則對(duì)合成多肽藥物的制備工藝、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性研究等方面提出了相應(yīng)的技術(shù)要求，在當(dāng)時(shí)對(duì)多肽藥物的研究和開發(fā)起到了積極的指導(dǎo)作用。但隨著藥品開發(fā)、質(zhì)控理念的提升，未見國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則進(jìn)行相應(yīng)更新。如何結(jié)合最新藥品研發(fā)理念，合理開發(fā)并控制多肽類藥物的質(zhì)量具有重要意義。

2、多肽原料藥質(zhì)控概況

目前，國內(nèi)外藥典收載了十幾個(gè)合成多肽藥物，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的控制項(xiàng)目主要包括: 外觀、比旋度、鑒別、酸度、溶液澄清度與顏色、氨基酸組成、殘留溶劑( 醋酸、三氟乙酸) 、水分、有關(guān)物質(zhì)、微生物限度、含量等。美國藥典委員會(huì)多肽專家小組于2014 年發(fā)表了相關(guān)文章，論述了多肽藥物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)分析方法，見表1。質(zhì)控項(xiàng)目中氨基酸序列、肽譜、氨基酸組成等為多肽類藥物特有質(zhì)控項(xiàng)目，也是多肽藥物的常規(guī)檢查項(xiàng)目。與經(jīng)典小分子化藥相比，合成多肽藥物在鑒別和有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目存在一定的特殊性。

2.1 鑒別

藥典收載的合成多肽類原料藥鑒別項(xiàng)目多為以下方法: 高效液相色譜法( HPLC 法，色譜條件與含量測(cè)定項(xiàng)下方法相同) 、紅外法、雙縮脲顯色反應(yīng)等。對(duì)于多肽類藥物來說，上述鑒別項(xiàng)目專屬性較差，需考慮增加專屬性更強(qiáng)的檢測(cè)手段進(jìn)行鑒別考察，如肽譜、核磁或質(zhì)譜等鑒別方法。如現(xiàn)行版美國藥典中，收載的去氨加壓素原料藥，鑒別項(xiàng)目采用質(zhì)譜檢測(cè); 現(xiàn)行版歐洲藥典中，收載的布舍瑞林和戈舍瑞林原料藥鑒別項(xiàng)目采用核磁檢測(cè)。采用質(zhì)譜法鑒別，其結(jié)果應(yīng)在理論值的±1.0質(zhì)量單位內(nèi)。

核磁共振光譜鑒別適用于氨基酸數(shù)目較少的多肽藥物，對(duì)于超過10 個(gè)氨基酸殘基的多肽，核磁共振光譜數(shù)據(jù)分析會(huì)受到一定的挑戰(zhàn)，可以選擇使用肽譜進(jìn)行鑒別研究。美國藥典委員會(huì)多肽專家小組建議: 如選擇HPLC 定位方法作為鑒別方法，應(yīng)對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品主峰的保留時(shí)間進(jìn)行比較，并要求標(biāo)準(zhǔn)品和樣品等劑量混合進(jìn)樣時(shí)，能得到單峰。

2.2 有關(guān)物質(zhì)

合成多肽藥物的雜質(zhì)譜復(fù)雜，包含由起始物料引入的雜質(zhì)、工藝相關(guān)的雜質(zhì)和降解產(chǎn)生的雜質(zhì)等。為實(shí)現(xiàn)有效檢出各潛在雜質(zhì)，通常需要采用多種不同原理的檢測(cè)方法如反相HPLC 法、離子交換HPLC 法、分子排阻HPLC 法等。如某進(jìn)口39 肽藥物，原料藥中控手段采用反相HPLC 法控制13 個(gè)已知雜質(zhì)、最大未知單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì); 離子交換HPLC 法控制2 個(gè)特定雜質(zhì); 分子排阻HPLC法控制二聚體等聚合物雜質(zhì)。如經(jīng)過充分的方法學(xué)驗(yàn)證，也可以采用單一的HPLC 方法。

現(xiàn)行版歐洲藥典通則中提出的多肽原料藥雜質(zhì)限度要求比ICH Q3A 指導(dǎo)原則的要求更寬泛，報(bào)告閾值、鑒定閾值和界定閾值分別為0.1%，0.5% 和1.0%。主要依據(jù)可能是與傳統(tǒng)小分子藥物的雜質(zhì)相比，多肽類雜質(zhì)引發(fā)毒理學(xué)問題的風(fēng)險(xiǎn)較低。美國藥典委員會(huì)多肽專家小組對(duì)多肽藥物的雜質(zhì)限度存在其他要求，認(rèn)為不同的多肽藥物的活性存在較大差異，不同的雜質(zhì)可能同樣存在活性的差別，同時(shí)多肽類藥物多為注射劑，風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。因此，該小組認(rèn)為多肽藥物雜質(zhì)限度的制定應(yīng)該結(jié)合特定品種進(jìn)行具體分析。

3、雜質(zhì)譜研究

如《制備工藝和過程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》所述，多肽藥物雜質(zhì)譜復(fù)雜，應(yīng)結(jié)合起始物料情況、制備工藝和穩(wěn)定性考察結(jié)果對(duì)多肽藥物進(jìn)行系統(tǒng)的雜質(zhì)譜分析。目前，國內(nèi)申請(qǐng)人向CFDA 遞交的合成多肽藥物雜質(zhì)譜研究資料要么不夠充分，考察雜質(zhì)較少，未對(duì)由起始物料引入的雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)等進(jìn)行系統(tǒng)的考察; 要么考察數(shù)十個(gè)雜質(zhì)，堆積“龐大”的雜質(zhì)譜研究資料，將合成、降解引入的雜質(zhì)與其他雜質(zhì)混為一體，缺乏針對(duì)性分析和研究。以某28 肽藥物為例，共考察了65 個(gè)潛在雜質(zhì)，所研究的雜質(zhì)譜中有23 個(gè)缺失10 ～ 16 個(gè)氨基酸殘基的缺失肽雜質(zhì)，暫且不考慮上述雜質(zhì)在氨基酸偶聯(lián)過程中生成的可能性，該產(chǎn)品制備工藝最后精制過程中有柱層析提純步驟，缺失氨基酸數(shù)目較多的缺失肽雜質(zhì)性質(zhì)與目標(biāo)多肽性質(zhì)相差較大，即使在氨基酸偶聯(lián)過程中能產(chǎn)生上述雜質(zhì)，在柱層析過程中也能有效除去，引入終產(chǎn)品的可能性很小，提供的終產(chǎn)品檢測(cè)報(bào)告中證明上述雜質(zhì)在終產(chǎn)品中均不存在。另外，本品雜質(zhì)譜研究中，對(duì)潛在易水解和易消旋的氨基酸引入的雜質(zhì)均未進(jìn)行針對(duì)性研究，因此盡管考察雜質(zhì)數(shù)量很多，雜質(zhì)譜研究仍存在較大缺陷。綜上，結(jié)合對(duì)氨基酸的性質(zhì)、整個(gè)制備過程和潛在的降解途徑的理解，對(duì)合成多肽的雜質(zhì)譜研究尤為重要。

美國藥典委員會(huì)多肽專家小組發(fā)表的文章中，涉及了合成多肽藥物雜質(zhì)譜研究內(nèi)容和考察方法，見表2 和表3?！吨苽涔に嚭瓦^程控制對(duì)合成多肽藥物有關(guān)物質(zhì)的影響》一文中也對(duì)可能由起始物料和制備過程中引入的缺失肽、錯(cuò)結(jié)肽等雜質(zhì)進(jìn)行了討論。本文主要針對(duì)差向肽雜質(zhì)、鏈端雜質(zhì)、側(cè)鏈雜質(zhì)、氧化雜質(zhì)等進(jìn)行討論。

3.1 差向肽雜質(zhì)

差向肽雜質(zhì)為氨基酸序列中含1 個(gè)或多個(gè)非預(yù)期手性構(gòu)型的氨基酸殘基所形成的肽鏈，差向肽雜質(zhì)可能形成于原料氨基酸中的光學(xué)異構(gòu)體，因此需要對(duì)該類原料進(jìn)行嚴(yán)格控制; 也可能形成于肽鏈合成過程中差向異構(gòu)化。目前已知的差向異構(gòu)化機(jī)理包括: 直接烯醇化和生成惡唑酮( 氮雜內(nèi)酯) 。其機(jī)制見圖1。在Fmoc 保護(hù)策略的固相合成工藝中，由于避免了活化肽鏈端羧基，差向肽主要形成機(jī)理為氨基酸偶聯(lián)過程中直接烯醇化，在氨基酸偶聯(lián)過程中所使用的催化劑等堿性試劑具有催化脫氫作用，形成碳負(fù)離子，而部分氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)具有穩(wěn)定該碳負(fù)離子的作用，因此在偶聯(lián)過程中易產(chǎn)生

相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)，如半胱氨酸( Cys) 、組氨酸( His) 。

相對(duì)于其他類型雜質(zhì)來說，差向肽雜質(zhì)鑒定和分離均有較大難度。尤其對(duì)于含有氨基酸數(shù)目較多的多肽藥物，對(duì)每個(gè)手性氨基酸均利用合成相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)對(duì)照品，使用HPLC 出峰時(shí)間對(duì)比鑒定的方法工作量巨大?？刹捎寐然跠Cl］/氘代水［D2O］水解衍生后，采用手性氣相色譜-質(zhì)譜( GCMS)來測(cè)定每個(gè)氨基酸手性異構(gòu)體的含量，鑒別出易產(chǎn)生消旋的氨基酸，進(jìn)一步制備出相應(yīng)的差向肽雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行HPLC 出峰時(shí)間對(duì)比鑒定，證明擬定分析方法可以有效檢出易產(chǎn)生的差向肽雜質(zhì)。

3.2 鏈末端雜質(zhì)

鏈末端雜質(zhì)包括兩大類: 一類是N 端?；駽 端脫酰胺化產(chǎn)生的雜質(zhì)。該類雜質(zhì)在合成或制備過程中較易得到雜質(zhì)對(duì)照品，研究難度不大。另一類雜質(zhì)是由鏈末端活性基團(tuán)“反咬”所形成的雜質(zhì)，如N 端的氮原子對(duì)第2 個(gè)與第3 個(gè)氨基酸殘基之間酰胺鍵中的羰基發(fā)生親核進(jìn)攻，隨后導(dǎo)致上述2 個(gè)氨基酸殘基發(fā)生截?cái)?，生成二酮哌嗪類物質(zhì)，肽鏈生成少2 個(gè)氨基酸的缺失肽雜質(zhì)。當(dāng)N 端為位阻較小的脯氨酸，甘氨酸殘基時(shí)，有利于上述副反應(yīng)的發(fā)生。另一方面，如N 端氨基酸殘基為谷氨酰胺時(shí)，則焦谷氨酸生成反應(yīng)可能性很大。與上述反應(yīng)機(jī)制類似，即N 端氮原子進(jìn)攻谷氨酰胺側(cè)鏈羰基碳后生成焦谷氨酸多肽類似物。N 端殘基為天冬酰胺時(shí)也可發(fā)生這一轉(zhuǎn)化過程。二酮哌嗪和焦谷氨酸降解機(jī)制見圖2。

3.3 側(cè)鏈雜質(zhì)

側(cè)鏈雜質(zhì)主要可分為2 類: 側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)引入的雜質(zhì)和氨基酸側(cè)鏈本身具有反應(yīng)活性引入的雜質(zhì)。在多肽合成過程中，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在酸解脫除過程中，可能存在脫除不完全，同時(shí)形成的碳正離子可能與肽鏈中潛在的親核位點(diǎn)偶聯(lián)，形成其他雜質(zhì)。此類雜質(zhì)一般會(huì)表現(xiàn)出與目標(biāo)多肽分子量、極性等方面的差異，因此采用適當(dāng)?shù)氖侄慰梢猿浞终f明。

由氨基酸側(cè)鏈本身的反應(yīng)活性引入雜質(zhì)的分析則需建立在對(duì)所組成氨基酸性質(zhì)充分理解的基礎(chǔ)上，較常見的是由谷氨酰胺、天冬酰胺側(cè)鏈酰胺鍵水解產(chǎn)生的降解雜質(zhì)。上述氨基酸可以進(jìn)一步發(fā)生如下副反應(yīng)，由天冬酰胺水解產(chǎn)生的天冬氨酸，或多肽序列中含有的天冬氨酸，則易生成琥珀酰亞胺結(jié)構(gòu)，通過C 端酰胺基氮原子對(duì)天冬酰胺或天冬氨酸殘基的γ-羰基發(fā)生親核進(jìn)攻，形成五元琥珀酰亞胺環(huán)的反應(yīng)。弱酸性條件有利于上述成環(huán)反應(yīng)，生成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在生理?xiàng)l件和堿性條件下均不穩(wěn)定，可發(fā)生消旋化。琥珀酰亞胺環(huán)的消旋化和水解可生成由L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-異天冬氨酸和D-異天冬氨酸組成的混合物，因此可使原天冬酰胺殘基發(fā)生脫酰胺基化和消旋化，或可使原天冬氨酸殘基發(fā)生異構(gòu)化和消旋化生成系列雜質(zhì)。如肽鏈中含有谷氨酰胺或谷氨酸時(shí)，也可發(fā)生類似的副反應(yīng)。琥珀酰亞胺降解機(jī)制見圖3。

精氨酸側(cè)鏈可以發(fā)生氨基化，反應(yīng)生成一級(jí)胺，轉(zhuǎn)化為鳥氨酸殘基的副反應(yīng)。該鳥氨酸殘基含1 個(gè)未受保護(hù)的氨基，因此可與其他氨基酸殘基發(fā)生偶聯(lián)，進(jìn)一步生成其他雜質(zhì)。

半胱氨酸中碳硫鍵在氫氧根離子催化下可發(fā)生β-消除的副反應(yīng)，該副反應(yīng)將生成2 種新殘基( 即脫氫丙氨酸殘基和硫代半胱氨酸殘基) 。脫氫丙氨酸可與合成體系中含有的賴氨酸或其他含有活性氨基化合物反應(yīng)，發(fā)生賴氨酸-丙氨酸交聯(lián)，生成聚集體雜質(zhì)，硫代半胱氨酸則可進(jìn)一步降解為含巰基的產(chǎn)物，相關(guān)降解途徑見圖4。絲氨酸和蘇氨酸殘基也可能發(fā)生β-消除副反應(yīng)。

酸殘基可能發(fā)生氧化或還原反應(yīng)。已在卡貝縮宮素和依來多辛中分別發(fā)現(xiàn)了因半胱氨酸和甲硫氨酸殘基氧化而形成的雜質(zhì)。上述雜質(zhì)相對(duì)于目標(biāo)序列多肽的質(zhì)量差異為16，32 和48 Da，為不同氧化階段產(chǎn)生的雜質(zhì)，即亞砜、砜和磺酸。組氨酸和賴氨酸也易發(fā)生氧化，分別生成2-氧代-組氨酸和氨基己二酸，貯存過程中長時(shí)間光照或暴露在空氣中均可導(dǎo)致生成氧化雜質(zhì)。此外，色氨酸側(cè)鏈在酸性條件下的反應(yīng)活性較高，可發(fā)生氧化生成系列雜質(zhì)，還可發(fā)生還原反應(yīng)。易發(fā)生氧化和還原的氨基酸殘基的總結(jié)情況見圖5。

3.5 多聚體雜質(zhì)

多肽藥物在純化和放置過程中，由于端基具有反應(yīng)活性或二硫鍵的改變等，可能生成一定量的多聚體雜質(zhì)。如去氨加壓素中，發(fā)現(xiàn)并鑒定出的多聚體雜質(zhì)有6 種之多。多聚體雜質(zhì)一般可使用分子排阻色譜法進(jìn)行有效的檢測(cè)。

4、小結(jié)

合成多肽藥物的開發(fā)需要建立在對(duì)多肽藥物充分理解的基礎(chǔ)上，建立全面的質(zhì)控策略。雜質(zhì)譜研究應(yīng)對(duì)起始物料引入的雜質(zhì)、制備工藝中生成的雜質(zhì)、降解過程產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行充分考察，保證雜質(zhì)譜研究的全面性。