分析方法轉移是制藥行業(yè)中常見的技術轉移，常見的情形有在分析研發(fā)實驗室間的轉移；研發(fā)實驗室與QC實驗室間的轉移；樣品生產(chǎn)地點變更時，QC實驗室間的轉移。藥物研發(fā)早期，對分析方法轉移的法規(guī)要求不高；在研發(fā)后期或者商業(yè)化階段，方法在QC實驗室之間的轉移，對定性與定量結果的一致性有較高要求。任何結果的偏離要非常小心，否則易產(chǎn)生超限或超趨（OOX）的結果。方法轉移前，如果方法驗證與耐用性的研究比較充分，對方法的認知比較了解，方法轉移時出現(xiàn)檢驗結果偏移時會能有足夠的信息與手段來應對與解決。

方法轉移考察的參數(shù)早期通常有精密度與系統(tǒng)適用性數(shù)據(jù)對比；后期通常會有精密度、準確度和系統(tǒng)適用性等數(shù)據(jù)對比。精密度和準確度的數(shù)據(jù)測試，與方法條件與參數(shù)設置相關，也與不同實驗室儀器系統(tǒng)密切相關。

本文試著從色譜方法自身、色譜儀器系統(tǒng)部分和儀器系統(tǒng)差異性等內(nèi)容討論方法轉移的一些常見色譜儀系統(tǒng)的考量與挑戰(zhàn)。

1. 分析方法條件

一個有效成功的分析方法轉移，首先是方法自身處于可控狀態(tài)，方法有可控的條件與參數(shù)，包括一些操作注意事項。表1是液相色譜方法常見的條件與參數(shù)：

表1液相色譜方法常見條件

方法轉移要考慮的元素有方法程序、樣品配制、化學試劑、樣品配制、其它的設備附件、色譜柱、流動相，以及色譜儀系統(tǒng)。分析方法操作人員也是一個關鍵元素，因為方法的知識交流與傳遞非常重要。一個有經(jīng)驗的分析人員，對于方法有相當?shù)牧私?，哪些地方需要特別注意，哪些地方是方法運行的關鍵。在與接收方實驗人員交流與培訓時，這些經(jīng)驗知識非常重要。方法文件的撰寫需要有經(jīng)驗的分析人員參與，每一個關鍵操作步驟都有詳盡的描述，否則轉移后樣品配制的操作方式不同，都有可能導致系統(tǒng)適用性結果不同。樣品配制用的化學試劑盡量用同一純度或同一廠家。樣品配制設備，如pH計、吸液槍/管、天平等，需要有實驗室可靠的校驗方可使用。 

進行方法轉移時需要根據(jù)藥物的研發(fā)階段和方法的需求進行適當?shù)娘L險評估，如圖1。色譜儀系統(tǒng)、流動相、樣品處理和色譜柱是影響方法使用和轉移的主要因素。

色譜柱是實驗室間方法轉移差異性的關鍵原因。色譜柱是分析方法的核心元素，它直接影響到系統(tǒng)適用性結果。方法轉移如能嚴格要求采用同一廠家同一型號的色譜柱，可以很大程度減少色譜柱對于方法的影響。常用的C18?C8等硅烷色譜柱，大廠家大品牌的技術很成熟，批次與批次間的差異性很小。同一廠家同一型號的新老色譜柱由于使用時間不同，柱效會有差異，這是不同實驗室間柱效不同的主要原因，因此方法轉移時盡量使用新的色譜柱，減少柱效對方法的影響。在方法轉移前，如有色譜柱耐用性的研究考察，將減少方法轉移的技術困難。

流動相的制備也是方法轉移差異性的主要原因。流動相組成包括水、有機溶劑、緩沖鹽或酸堿添加劑。水與有機溶劑的化學純度影響色譜圖的基線波動與噪音，緩沖鹽與酸堿添加劑的化學純度是色譜圖中出現(xiàn)鬼峰的主要因素。流動相的新鮮制備、pH值的穩(wěn)定性和微生物的濾除會減少色譜圖中雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，從而確保前后色譜圖的一致性。

流動相的不同制備方式會導致方法的差異性。比如制備一個50/50的甲醇/水的混合溶劑有四種方式：①先加入500ml的水至1000ml的容量瓶中，用甲醇稀釋至1000ml;②先加入500ml的甲醇至1000ml的容量瓶中，用水稀釋至1000ml;③分別使用量筒量取500ml的水與甲醇混合；④分別稱量500g的水與甲醇混合。由于水與甲醇混合時會有放熱的情況，水與甲醇的密度不同，因此這四種方式制備得到的混合溶劑實際組成是有一些差別的。這種差別會導致它作為洗脫劑時洗脫能力不同，從而導致色譜峰的保留差異。

因此在方法文件中要盡可能描述清楚流動相的配制過程、樣品的配制過程和系統(tǒng)適用性溶液的配制過程。雙方實驗室嚴格按照方法程序的要求進行操作，會減少由于操作本身而導致的差異。

流動相的配制過程客觀上會存在一些差異，因此在方法程序上可以設計成色譜系統(tǒng)的多項混合洗脫，使用泵系統(tǒng)進行流動相混合，減少人工配制導致的比例差異。

不同實驗室的色譜儀系統(tǒng)客觀上會存在一些差異，在方法轉移前如能有方法耐用性的研究數(shù)據(jù)支持，或者參考USP<621>通則，適當調(diào)整方法參數(shù)，減少這些差別和滿足方法系統(tǒng)適用性的要求。

2. 色譜儀系統(tǒng)的差別

色譜儀系統(tǒng)是方法轉移的重要影響因素，也是導致方法不一致的主要原因。色譜儀是由多個模塊組成，不同模塊有不同型號，實驗室間的色譜儀器客觀上很難保持完全一致，這種差異會導致方法轉移后的差別。方法的使用壽命有時也長于色譜系統(tǒng)，儀器的更新速度也會增加方法一致性的難度。

色譜系統(tǒng)液體流動路徑會影響化合物的保留。這個路徑包括系統(tǒng)管線、進樣器和流動相混合器。管線按內(nèi)徑分有0.030’’、 0.020’’、 0.010’’、 0.007’’、 0.005’’、 0.0025’’等類型，一般來說，管線內(nèi)徑的大小對系統(tǒng)的體積影響不大，但內(nèi)徑不同的管線耐壓能力不同，壓力與流速相關。所以方法的流速與系統(tǒng)的最大耐壓會決定選擇哪種管線。進樣體積會影響峰形與分離度。極端的進樣體積，如50uL，峰形會變寬、對稱性變差，這是因為樣品在管路中心和壁處的層流速度不同，從而導致化合物被擴散。

色譜的泵系統(tǒng)或者溶劑傳遞系統(tǒng)是方法運行的關鍵因素。常見的有低壓四元混合單泵和高壓二元混合雙泵。等度方法相對簡單，受泵的影響較小。梯度方法較為復雜，流動相在系統(tǒng)中的比例受到泵工作原理的直接影響。低壓混合系統(tǒng)中流動相各種組分在到達泵之前就混合完成；高壓混合系統(tǒng)中每種溶劑通過專門的泵輸送至混合器中，流動相各溶劑比例通過各泵的相對流速來控制。同品牌色譜儀同型號的泵在不同實驗室間基本可以做到重復；不同品牌色譜儀，泵的型號不同，對于梯度方法轉移會帶來挑戰(zhàn)。

色譜儀延遲體積的大小會影響色譜峰保留。延遲體積是從流動相混合器到柱前入口處的流路體積。延遲體積一般在供應商提供的資料中可以查到，也可以通過實驗測試得到，即用兩通代替色譜柱，使用有吸收的物質(zhì)，設定梯度條件，觀察到的梯度中點與設置的程序梯度中點，兩間的差值為梯度延遲時間，乘以流速即為系統(tǒng)的延遲體積。如圖2.

延遲體積受流路內(nèi)徑的影響較小，主要受到色譜儀混合器體積的影響?；旌掀鞔嬖诓煌w積大小的產(chǎn)品，體積大，梯度的延遲效應明顯，復雜的樣品分離會影響較大。

混合器體積會影響系統(tǒng)和色譜柱的平衡時間，還有方法回到初始梯度的時間。這些影響在進行方法轉移時，實驗分析人員需要考慮。

前面提到泵的工作原理，有低壓與高壓混合兩種。在運行梯度方法時，它們的原理是不同的。低壓混合模式是各溶劑通過比例閥和在線混合器，溶劑按比例混合，然后通過單泵的高壓傳輸?shù)较到y(tǒng)。高壓混合模式是流動相通過各自的高壓泵，按流速來控制比例，然后在線混合輸出到管路中。在低壓混合系統(tǒng)中，柱活塞與泵頭之間有一定的空間，使得混合溶劑無法全體積輸出至管路中，這部分液體將會對系統(tǒng)體積的大小產(chǎn)生影響，從而增加梯度的延遲時間。

3. 如何保持不同實驗室的色譜儀系統(tǒng)一致性？

方法轉移的目標是要在雙方實驗室得到等效的分析結果。如前所述，如果不同實驗室色譜儀系統(tǒng)是相同的，理論上結果應是一致的?？陀^上不同實驗室間的設備會存在差異，比如色譜儀廠家、泵的類型、管線大小、進樣器、柱溫箱和檢測器等，還有分析人員的經(jīng)驗，實驗室的環(huán)境，都可能存在差異性，從而影響方法轉移的等效性結果。

色譜儀溶劑遞送系統(tǒng)是關鍵的影響因素，它影響著系統(tǒng)的延遲體積，最終會影響梯度保留時間。對于這種影響，有三種解決方式。

一是接收實驗室的梯度程序與初始系統(tǒng)的梯度程序準確地進行調(diào)整，使得各峰的保留時間保持一致。這種方式在實際操作中比較復雜的，依賴于方法本身和分析物的復雜性。也可參考USP<621>通則中的相關指南進行操作，但實施起來仍有困難。

二是通過物理性的增加或減少系統(tǒng)延遲體積，以匹配初始系統(tǒng)的延遲體積，如圖3。這種方式的本質(zhì)是增加或減少混合器的體積或數(shù)量，從而調(diào)整系統(tǒng)的體積。該方式比較容易操作與實現(xiàn)。

圖3: 改變混合器，調(diào)整系統(tǒng)延遲體積

三是調(diào)整進樣的時間程序，從而調(diào)整方法梯度開始時間。通過在進樣程序中設置進樣的時間，從而達到梯度開始后，進樣仍然可以延緩一段時間后開始，該操作類同于增加了一部分系統(tǒng)體積，從而增加了保留時間。如圖4, 它是整體增加或減少系統(tǒng)的體積，所以相當于整個延遲或加速方法梯度的間隔。

圖4: 調(diào)整梯度開始時間以匹配系統(tǒng)延遲體積

進樣系統(tǒng)在當前分析實驗室中基本實現(xiàn)了全部自動化。即由計算機程序控制，不同實驗室間的差異很小。不同品牌供應商的進樣原理可能不同，大部分是定量環(huán)加六通閥，加上洗針程序基本可以消除樣品殘留的影響，所以不同實驗室進樣系統(tǒng)對方法的轉移影響較小。

柱溫對于分析方法是一個重要參數(shù)，柱溫的控制對方法轉移非常重要，它影響色譜峰保留與選擇性。通常同品牌的柱溫控制箱原理是一樣的，不同品牌的柱溫控制箱會存在差異，它們都有各自的zhuanli保護。柱溫控制箱主要包括溫度傳感器、加熱元件、隔熱材料、漏液檢測、空氣循環(huán)、進風和出風系統(tǒng)、溶劑預熱等組件。這些組成部分，溶劑預熱會影響色譜峰的保留與選擇性，如圖5。因此不同品牌的色譜儀，要關注柱溫箱的控制設置，盡量保持一致的參數(shù)設置，減少柱溫對方法的影響。

圖5: 方法轉移時的流動相預熱

檢測器也是影響方法轉移的一個因素，商品化常用的紫外檢測器有單波長的UV或者全波和的PDA檢測器。方法轉移時檢測器帶寬或分辨率設置盡量保持一致，時間常量或濾波器保持一致。不同品牌檢測器的流通池會不一樣，流通池的體積會影響色譜峰峰寬，從而影響色譜峰峰高。選擇同體積的流動池，會減小對色譜峰的影響。

小結

本文主要以色譜方法為例，討論了方法轉移時需要關注的一些情況。方法與化合物的自身復雜性特點會影響方法轉移的難度，同時討論了色譜儀硬件系統(tǒng)在方法轉移時的影響以及常見的解決方式。

（作者簡介：曾文亮，從事新藥質(zhì)量控制和分析研發(fā)工作，個人公眾號：文亮頻道）

參考文獻：

1. Instrument Considerations in the Transfer ofChromatographic Methods, Part I: Method Considerations，LCGC North America,  2018, Volume36, Issue 9,Pages: 693–696.

2. Instrument Considerations in the Transfer ofChromatographic Methods, Part II: System Considerations，LCGC North America,  2018, Volume36, Issue 11, P824-829.

3. InstrumentConsiderations in the Transfer of Chromatographic Methods, Part III: AligningPerformance of Modules，LCGC NorthAmerica, 2019, Volume 37, Issue 3, P185–191